生物傳感器的研究現(xiàn)狀及應用

　　從1962年，Clark和Lyons最先提出生物傳感器的設想距今已有40 年。生物傳感器在發(fā)酵工藝、環(huán)境監(jiān)測、食品工程、臨床醫(yī)學、軍事及軍事醫(yī)學等方面得到了深度重視和廣泛應用。在最初15年里，生物傳感器主要是以研制酶電極制作的生物傳感器為主，但是由于酶的價格昂貴并不夠穩(wěn)定，因此以酶作為敏感材料的傳感器，其應用受到一定的限制。

　　近些年來，微生物固定化技術的不斷發(fā)展，產生了微生物電極。微生物電極以微生物活體作為分子識別元件，與酶電極相比有其獨到之處。它可以克服價格昂貴、提取困難及不穩(wěn)定等弱點。此外，還可以同時利用微生物體內的輔酶處理復雜反應。而目前，光纖生物傳感器的應用也越來越廣泛。而且隨著聚合酶鏈式反應技術（PCR）的發(fā)展，應用PCR的DNA生物傳感器也越來越多。

　　二、 研究現(xiàn)狀及主要應用領域

　　1、 發(fā)酵工業(yè)

　　各種生物傳感器中，微生物傳感器最適合發(fā)酵工業(yè)的測定。因為發(fā)酵過程中常存在對酶的干擾物質，并且發(fā)酵液往往不是清澈透明的，不適用于光譜等方法測定。而應用微生物傳感器則極有可能消除干擾，并且不受發(fā)酵液混濁程度的限制。同時，由于發(fā)酵工業(yè)是大規(guī)模的生產，微生物傳感器其成本低設備簡單的特點使其具有極大的優(yōu)勢。

　　（1）。 原材料及代謝產物的測定

　　微生物傳感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的測定，代謝產物如頭孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇類、青霉素、乳酸等的測定。測量的原理基本上都是用適合的微生物電極與氧電極組成，利用微生物的同化作用耗氧，通過測量氧電極電流的變化量來測量氧氣的減少量，從而達到測量底物濃度的目的。

　　在各種原材料中葡萄糖的測定對過程控制尤其重要，用熒光假單胞菌（Psoudomonas fluorescens）代謝消耗葡萄糖的作用，通過氧電極進行檢測，可以估計葡萄糖的濃度。這種微生物電極和葡萄糖酶電極型相比，測定結果是類似的，而微生物電極靈敏度高，重復實用性好，而且不必使用昂貴的葡萄糖酶。

　　當乙酸用作碳源進行微生物培養(yǎng)時，乙酸含量高于某一濃度會抑制微生物的生長，因此需要在線測定。用固定化酵母（Trichosporon brassicae），透氣膜和氧電極組成的微生物傳感器可以測定乙酸的濃度。

　　此外，還有用大腸桿菌（E.coli）組合二氧化碳氣敏電極，可以構成測定谷氨酸的微生物傳感器，將檸檬酸桿菌完整細胞固定化在膠原蛋白膜內，由細菌—膠原蛋白膜反應器和組合式玻璃電極構成的微生物傳感器可應用于發(fā)酵液中頭孢酶素的測定等等。

　　（2）。 微生物細胞總數(shù)的測定

　　在發(fā)酵控制方面，一直需要直接測定細胞數(shù)目的簡單而連續(xù)的方法。人們發(fā)現(xiàn)在陽極表面，細菌可以直接被氧化并產生電流。這種電化學系統(tǒng)已應用于細胞數(shù)目的測定，其結果與傳統(tǒng)的菌斑計數(shù)法測細胞數(shù)是相同的[1]。

　?。?）。 代謝試驗的鑒定

　　傳統(tǒng)的微生物代謝類型的鑒定都是根據微生物在某種培養(yǎng)基上的生長情況進行的。這些實驗方法需要較長的培養(yǎng)時間和專門的技術。微生物對底物的同化作用可以通過其呼吸活性進行測定。用氧電極可以直接測量微生物的呼吸活性。因此，可以用微生物傳感器來測定微生物的代謝特征。這個系統(tǒng)已用于微生物的簡單鑒定、微生物培養(yǎng)基的選擇、微生物酶活性的測定、廢水中可被生物降解的物質估計、用于廢水處理的微生物選擇、活性污泥的同化作用試驗、生物降解物的確定、微生物的保存方法選擇等[2]。

　　2、 環(huán)境監(jiān)測

　　（1）。 生化需氧量的測定

　　生化需氧量（biochemical oxygen dem–BOD）的測定是監(jiān)測水體被有機物污染狀況的最常用指標。常規(guī)的BOD測定需要5天的培養(yǎng)期，操作復雜、重復性差、耗時耗力、干擾性大，不宜現(xiàn)場監(jiān)測，所以迫切需要一種操作簡單、快速準確、自動化程度高、適用廣的新方法來測定。目前，有研究人員分離了兩種新的酵母菌種SPT1和SPT2，并將其固定在玻璃碳極上以構成微生物傳感器用于測量BOD，其重復性在±10%以內。將該傳感器用于測量紙漿廠污水中BOD的測定，其測量最小值可達2 mg/l，所用時間為5min[3]。還有一種新的微生物傳感器，用耐高滲透壓的酵母菌種作為敏感材料，在高滲透壓下可以正常工作。并且其菌株可長期干燥保存，浸泡后即恢復活性，為海水中BOD的測定提供了快捷簡便的方法[4]。

　　除了微生物傳感器，還有一種光纖生物傳感器已經研制出來用于測定河水中較低的BOD值。該傳感器的反應時間是15min，最適工作條件為30°C，pH=7。這個傳感器系統(tǒng)幾乎不受氯離子的影響（在1000mg/l范圍內），并且不被重金屬（Fe3+、Cu2+、Mn2+、Cr3+、Zn2+）所影響。該傳感器已經應用于河水BOD的測定，并且獲得了較好的結果[4]。

　　現(xiàn)在有一種將BOD生物傳感器經過光處理（即以TiO2作為半導體，用6 W燈照射約4min）后，靈敏度大大提高，很適用于河水中較低BOD的測量[5]。同時，一種緊湊的光學生物傳感器已經發(fā)展出來用于同時測量多重樣品的BOD值。它使用三對發(fā)光二極管和硅光電二極管，假單胞細菌（Pseudomonas fluorescens）用光致交聯(lián)的樹脂固定在反應器的底層，該測量方法既迅速又簡便，在4℃下可使用六周，已經用于工廠廢水處理的過程中[5]。

　?。?）。 各種污染物的測定

　　常用的重要污染指標有氨、亞鹽、硫化物、磷酸鹽、致癌物質與致變物質、重金屬離子、酚類化合物、表面活性劑等物質的濃度。目前已經研制出了多種測量各類污染物的生物傳感器并已投入實際應用中了。

　　測量氨和鹽的微生物傳感器，多是用從廢水處理裝置中分離出來的硝化細菌和氧電極組合構成。目前有一種微生物傳感器可以在黑暗和有光的條件下測量鹽和亞鹽（NOx-），它在鹽環(huán)境下的測量使得它可以不受其他種類的氮的氧化物的影響。用它對河口的NOx-進行了測量，其效果較好[6]。

　　硫化物的測定是用從硫鐵礦附近酸性土壤中分離篩選得到的專性、自養(yǎng)、好氧性氧化硫硫桿菌制成的微生物傳感器。在pH=2.5、31℃時一周測量200余次，活性保持不變，兩周后活性降低20%。傳感器壽命為7天，其設備簡單，成本低，操作方便。目前還有用一種光微生物電極測硫化物含量，所用細菌是Chromatium.SP，與氫電極連接構成[7]。

　　最近科學家們在污染區(qū)分離出一種能夠發(fā)熒光的細菌，此種細菌含有熒光基因，在污染源的刺激下能夠產生熒光蛋白，從而發(fā)出熒光?？梢酝ㄟ^遺傳工程的方法將這種基因導入合適的細菌內，制成微生物傳感器，用于環(huán)境監(jiān)測。現(xiàn)在已經將熒光素酶導入大腸桿菌（E.coli）中，用來檢測砷的有毒化合物[8]。

　　水體中酚類和表面活性劑的濃度測定已經有了很大的發(fā)展。目前，有9種革蘭氏陰性細菌從西西伯利亞石油盆地的土壤中分離出來，以酚作為唯一的碳源和能源。這些菌種可以提高生物傳感器的感受器部分的靈敏度。它對酚的監(jiān)測極限為5 ?10-9mol。該傳感器工作的最適條件為：pH=7.4、35℃，連續(xù)工作時間為30h[9]。還有一種假單胞菌屬（Pseudomonas rathonis）制成的測量表面活性劑濃度的電流型生物傳感器，將微生物細胞固定在凝膠（瓊脂、瓊脂糖和海藻酸鈣鹽）和聚乙醇膜上，可以用層析試紙GF/A，或者是谷氨酸醛引起的微生物細胞在凝膠中的交聯(lián)，長距離的保持它們在高濃度表面活性劑檢測中的活性和生長力。該傳感器能在測量結束后很快的恢復敏感元件的活性[10]。

　　還有一種電流式生物傳感器，用于測定有機磷殺蟲劑，使用的是人造酶。利用有機磷殺蟲劑水解酶，對硝基酚和二乙基酚的測量極限為100?10-9mol，在40℃只要4min[11]。還有一種新發(fā)展起來的磷酸鹽生物傳感器，使用丙酮酸氧化酶G，與自動系統(tǒng)CL-FIA臺式電腦結合，可以檢測（32~96）？10-9mol的磷酸鹽，在25°C下可以使用兩周以上，重復性高[12]。

　　最近，有一種新型的微生物傳感器，用細菌細胞作為生物組成部分，測定地表水中壬基酚（nonyl-phenol etoxylate --NP-80E）的含量。用一個電流型氧電極作傳感器，微生物細胞固定在氧電極上的透析膜上，其測量原理是測量毛孢子菌屬（Trichosporum grablata）細胞的呼吸活性。該生物傳感器的反應時間為15~20min，壽命為7~10天（用于連續(xù)測定時）。在濃度范圍0.5~6.0mg/l內，電信號與NP-80E濃度呈線性關系，很適合于污染的地表水中分子表面活性劑的檢測[13]。

　　除此之外，污水中重金屬離子濃度的測定也是不容忽視的。目前已經成功設計了一個完整的，基于固定化微生物和生物體發(fā)光測量技術上的重金屬離子生物有效性測定的監(jiān)測和分析系統(tǒng)。將弧菌屬細菌（Vibrio fischeri）體內的一個操縱子在一個銅誘導啟動子的控制下導入產堿桿菌屬細菌（Alcaligenes eutrophus （AE1239））中，細菌在銅離子的誘導下發(fā)光，發(fā)光程度與離子濃度成正比。將微生物和光纖一起包埋在聚合物基質中，可以獲得靈敏度高、選擇性好、測量范圍廣、儲藏穩(wěn)定性強的生物傳感器。目前，這種微生物傳感器可以達到最低測量濃度1?10-9mol[14]。

　　還有一種專門測量銅離子的電流型微生物傳感器。它用酒釀酵母（Saccharomyces cerevisiae）重組菌株作為生物元件，這些菌株帶有酒釀酵母CUP1基因上的銅離子誘導啟動子與大腸桿菌lacZ基因的融合體。其工作原理，首先是CUP1啟動子被Cu2+誘導，隨后乳糖被用作底物進行測量。如果Cu2+存在于溶液中，這些重組體細菌就可以利用乳糖作為碳源，這將導致這些好氧細胞需氧量的改變。該生物傳感器可以在濃度范圍（0.5~2）？10-3mol范圍內測定CuSO4溶液。目前已經將各類金屬離子誘導啟動子轉入大腸桿菌中，使得大腸桿菌會在含有各種金屬離子的的溶液中出現(xiàn)發(fā)光反應。根據它發(fā)光的強度可以測定重金屬離子的濃度，其測量范圍可以從納摩爾到微摩爾，所需時間為60~100min[15][16]。

　　用于測量污水中鋅濃度的生物傳感器也已經研制成功，使用嗜堿性細菌Alcaligenes cutrophus，并用于對污水中鋅的濃度和生物有效性進行測量，其結果令人滿意[17]。

　　估測河口出水流污染情況的海藻傳感器是由一種螺旋藻屬藍細菌（ cyanobacterium Spirlina subsalsa）和一個氣敏電極構成的。通過監(jiān)測光合作用被抑制的程度來估測由于環(huán)境污染物的存在而引起水的毒性變化。以標準天然水為介質，對三種主要污染物（重金屬、除草劑、氨基甲酸鹽殺蟲劑）的不同濃度進行了測定，均可監(jiān)測到它們的有毒反應，重復性和再生性都很高[18]。

　　近來由于聚合酶鏈式反應技術（PCR）的迅猛發(fā)展及其在環(huán)境監(jiān)測方面的廣泛應用，不少科學家開始著手于將它與生物傳感器技術結合應用。有一種應用PCR技術的DNA壓電生物傳感器，可以測定一種特殊的細菌毒素。將生物素酰化的探針固定在裝有鏈酶抗生素鉑金表面的石英晶體上，用1?10-6mol的鹽酸可以使循環(huán)式測量在同一晶體表面進行。用細菌中提取的DNA樣品進行同樣的雜交反應并由PCR放大，產物為氣單胞菌屬（Aeromonas hydrophila）的一種特殊基因片斷。這種壓電生物傳感器可以鑒別樣品中是否含有這種基因，這為從水樣中檢測是否含帶有這種病原的各種氣單胞菌提供了可能[19]。

　　還有一種通道生物傳感器可以檢測浮游植物和水母等生物體產生的腰鞭毛蟲神經毒素等毒性物質，目前已經能夠測量在一個浮游生物細胞內含有的極微量的PSP毒素[20]。DNA傳感器也在迅速的得到應用，目前有一種小型化DNA生物傳感器，能將DNA識別信號轉換為電信號，用于測量水樣中隱孢子和其他水源傳染體。該傳感器著重于改進核酸的識別作用和加強該傳感器的特異性和靈敏性，并尋求將雜交信號轉化為有用信號的新方法，目前研究工作為識別裝置和轉換裝置的一體化[21]。

　　微藻素是一種從藍藻細菌引起的水華中產生的細菌肝毒素，一種固定有表面細胞質?；蚪M的生物傳感器已經制得，用于測量水中微藻素的含量，它直接的測量范圍是50~1000 ?10-6g/l[22]。

　　一種基于酶的抑制性分析的多重生物傳感器用于測量毒性物質的設想也已經提出。在這種多重生物傳感器中，應用了兩種傳導器—對pH敏感的電子晶體管和熱敏性的薄膜電極，以及三種酶—尿素酶、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。該生物傳感器的性能已經得到測試，效果較好[23]。

　　除了發(fā)酵工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測，生物傳感器還深入的應用于食品工程、臨床醫(yī)學、軍事及軍事醫(yī)學等領域，主要用于測量葡萄糖、乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各種氨基酸，以及各種致癌和致變物質。

　　三、 討論與展望

　　美國的Harold H.Weetal指出，生物傳感器商品化要具備以下幾個條件：足夠的敏感性和準確性、易操作、價格便宜、易于批量生產、生產過程中進行質量監(jiān)測。其中，價格便宜決定了傳感器在市場上有無競爭力。而在各種生物傳感器中，微生物傳感器最大的優(yōu)點就是成本低、操作簡便、設備簡單，因此其在市場上的前景是十分巨大和誘人的。相比起來，酶生物傳感器等的價格就比較昂貴。但微生物傳感器也有其自身的缺點，主要的缺點就是選擇性不夠好，這是由于在微生物細胞中含有多種酶引起的?，F(xiàn)已有報道加專門抑制劑以解決微生物電極的選擇性問題。除此之外，微生物固定化方法也需要進一步完善，首先要盡可能保證細胞的活性，其次細胞與基礎膜結合要牢固，以避免細胞的流失。另外，微生物膜的長期保存問題也待進一步的改進，否則難于實現(xiàn)大規(guī)模的商品化。

　　總之，常用的微生物電極和酶電極在各種應用中各有其優(yōu)越之處。若容易獲得穩(wěn)定、高活性、低成本的游離酶，則酶電極對使用者來說是最理想的。相反的，若生物催化需經過復雜途徑，需要輔酶，或所需酶不宜分離或不穩(wěn)定時，微生物電極則是更理想的選擇。而其他各種形式的生物傳感器也在蓬勃發(fā)展中，其應用也越來越廣泛。隨著固定化技術的進一步完善，隨著人們對生物體認識的不斷深入，生物傳感器必將在市場上開辟出一片新的天地。